Studio: Cannabinoidi e diminuzione del Tumore alla Prostata

L’inibizione della crescita del tumore alla prostata delle cellule PC-3 umana da parte dei cannabinoidi R (+)-Methanandamide e JWH-015: Coinvolgimento di CB ₂

Traduzione di Stefano Auditore;  Articoli di: N Olea-Herrero , ¹ D Vara , ¹ S Malagarie-Cazenave , ¹ e I Díaz-Laviada ^1, *

ESTRATTO sito: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2743360/

Background:

Abbiamo precedentemente dimostrato che i cannabinoidi inducono l’inibizione della crescita ed apoptosi in cancro alla prostata cellule PC-3, che esprimono alti livelli di tipi di recettori cannabinoidi 1 e 2 (CB ₁ e CB ₂ ). In questo studio, abbiamo studiato il ruolo della BC ₂ recettore nel azione anti-proliferativa dei cannabinoidi e la trasduzione del segnale innescata da ligazione recettore.

Metodi:

Le linee di cellule umane del cancro della prostata, ovvero PC-3, DU-145, LNCaP e sono stati utilizzati per questo studio. La proliferazione cellulare è stata misurata mediante saggio MTT proliferazione, [ ³ H]-timidina saggio di incorporazione e lo studio del ciclo cellulare mediante citometria di flusso. Quantificazione ceramide è stata effettuata utilizzando il metodo chinasi DAG. Il CB ₂recettori ammutolisce con specifiche piccoli RNA interferenti, ed è stato bloccato farmacologicamente con SR 144528. In vivo sono stati condotti studi per l’induzione di tumori della prostata xenotrapianto in topi nudi.

Risultati:

Abbiamo trovato che l’anandamide analogici, R (+)-Methanandamide (TEM), così come JWH-015, un sintetico CB ₂ agonista, esercita effetti antiproliferativi in cellule PC-3. R (+)-Methanandamide-e JWH-015-indotta morte cellulare è stato salvato da un trattamento con il CB ₂antagonista del recettore, SR 144528. Down-regulation dei CB ₂ espressione invertito gli effetti del JWH-015, che conferma il coinvolgimento di CB ₂ l’effetto pro-apoptotico dei cannabinoidi. Analizzando ulteriormente il meccanismo di inibizione della crescita cellulare JWH-015-indotta, abbiamo trovato che JWH-015 innescato un de novo sintesi della ceramide, che è stato coinvolto nella morte cellulare indotto dai cannabinoidi, in quanto bloccando la sintesi di ceramide con Fumonisina B1 ridotto morte cellulare.Vie di segnalazione attivate da JWH-015 incluso JNK (c-Jun N-terminal chinasi) accensione e Akt inibizione. In vivo trattamento con JWH-015 ha causato una significativa riduzione della crescita tumorale in topi.

Conclusioni:

Questo studio definisce il coinvolgimento di CB ₂ segnalazione mediata in in vivo e in vitroinibizione della crescita delle cellule tumorali della prostata e suggerisce che CB ₂ agonisti hanno un potenziale interesse terapeutico e meritano di essere esplorate nel trattamento del cancro alla prostata.

Parole chiave: cannabinoidi, CB ₂ recettori, ceramide, PC-3 cellule, il cancro alla prostata

Il cancro alla prostata è diventato il tumore più comune diagnosticato negli uomini ed è una delle principali malattie mortali nei paesi occidentali ( Ukraintseva et al , 2008 ). Nonostante i recenti progressi nella sua diagnosi e trattamento, le terapie attuali sono in grado di eliminare completamente le cellule tumorali della prostata androgeno-indipendente che rimangono dopo la terapia di ablazione degli androgeni ( Bahnson 2007 ). Così, la comprensione dei meccanismi coinvolti nel controllo della crescita tumorale e lo sviluppo di agenti chemiopreventivi sono i principali obiettivi della ricerca di base in oncologia.

I cannabinoidi, i componenti attivi di Cannabis sativa e loro derivati, esercitano un ampio spettro di azioni modulatori e attività farmacologiche nel cervello così come nella periferia, e quindi del potenziale terapeutico dei cannabinoidi ha guadagnato molta attenzione negli ultimi anni ( Kogan e Mechoulam 2007 ). Una delle aree più interessanti della ricerca attuale nel potenziale terapeutico dei cannabinoidi è il cancro. Prove recenti suggeriscono che i cannabinoidi sono potenti regolatori della crescita cellulare e la differenziazione. Essi hanno dimostrato di esercitare effetti anti-tumorali diminuendo vitalità, proliferazione, migrazione e adesione su varie cellule tumorali, suggerendo in tal modo il potenziale uso di cannabinoidi nel trattamento dei gliomi, della prostata e della mammella e tumori di origine immunitaria ( Bifulco et al 2006 ; Flygare e Sander, 2008 ; Sarfaraz et al , 2008 ; Pisanti et al , 2009 ). I meccanismi dell’azione antitumorale dei cannabinoidi comprendono inibizione della proliferazione delle cellule tumorali, induzione di morte cellulare, inibizione della migrazione cellulare e metastasi, effetti anti-angiogenici e modulazione della risposta immunitaria ( Guzman, 2003 ; Flygare e Sander, 2008 ).Vari cannabinoidi, soprattutto anandamide e il THC, promuovono l’apoptosi di astrocitoma, glioma, neuroblastoma e feocromocitoma cellule in coltura da un percorso che coinvolge i recettori dei cannabinoidi ( Guzman, 2003 ; Goncharov et al , 2005 ; Velasco et al , 2007 ) e da una attivazione del reticolo di stress pathway ( Carracedo et al , 2006b ; Salazar et al , 2009a ). Inoltre, i cannabinoidi sintetici e naturali quali inibiscono la crescita delle cellule tumorali endocrino-correlati, come la tiroide, della mammella e cellule tumorali della prostata (rivisto nel Lopez-Rodriguez et al (2005) e Bifulco et al(2008) ). L’effetto antitumorale dei cannabinoidi è stata dimostrata sia in vitro ed in vivo , che interessano molteplici vie di segnalazione e processi biologici che sono stati implicati nello sviluppo del fenotipo maligno ( Bifulco et al , 2008 ). Cannabinoidi possono colpire le cellule tumorali legandosi ai recettori cannabinoidi o da un meccanismo recettore-indipendente. Due recettori cannabinoidi sono stati identificati mediante clonazione molecolare ad oggi: il CB ₁ recettore, che è altamente espresso nel cervello e presenti anche nei tessuti periferici, e il CB ₂ recettori, precedentemente creduto per essere espresso prevalentemente in cellule immunitarie ed ematopoietici, sebbene studi più recenti hanno anche identificato CB ₂ recettori nel cervello e nelle cellule endoteliali di origine diversa ( Pertwee, 2006 ,Mackie, 2008 ). Il CB ₂ recettori non è correlata alla psicoattività cannabinoidi, e quindi di mira questo recettore è una delle maggiori sfide nella ricerca terapeutica dei cannabinoidi ( Ashton et al , 2008 ).Dopo l’interazione con i recettori dei cannabinoidi, i cannabinoidi attivano diverse vie di segnalazione a seconda del tipo di cellula, che possono essere coinvolti nei loro effetti antiproliferativi come p38 MAPK e c-Jun N-terminal chinasi (JNK) attivazione, aumento della sintesi di pro- apoptotica ceramide sfingolipidi e diversi geni legati allo stress a valle espressi nel reticolo endoplasmatico ( Diaz-Laviada e Ruiz-Llorente, 2005 , Demuth e Molleman 2006 ). Ceramide, la molecola centrale del metabolismo degli sfingolipidi, generalmente media le risposte anti-proliferative, quali inibizione della crescita cellulare, induzione di apoptosi e / o modulazione della senescenza ( Saddoughi et al , 2008 ). Diversi agenti terapeutici che inducono apoptosi ceramide-dipendente in cellule cancerose esistono attualmente, e una serie di enzimi coinvolti nel metabolismo del ceramide stanno iniziando ad essere riconosciuti come potenziali bersagli per la terapia del cancro ( Savtchouk et al , 2007 ; Carpinteiro et al , 2008 ).Recenti ricerche hanno dimostrato che i cannabinoidi inducono l’accumulo di ceramide nelle cellule tumorali, che è legato alla effetto pro-apoptotico dei cannabinoidi in cellule tumorali ( Guzman et al , 2001 ; Velasco et al , 2005 ).

Cellule di cancro prostatico esprimono sia CB ₁ e CB ₂ recettori ( Ruiz-Llorente et al , 2003 ; Sanchez et al , 2003 ), la cui espressione è significativamente superiore che nelle cellule epiteliali normali della prostata ( Sarfaraz et al , 2005 ). L’impatto di cannabinoidi sulla vitalità delle cellule del cancro della prostata è variabile e dipende dalla dose utilizzata. Basse dosi inferiori al campo micromolare inducono l’espressione del recettore degli androgeni nella linea cellulare prostatica, LNCaP ( Sanchez et al , 2003 ), mentre dosi nell’intervallo di micromolare o superiore inducono apoptosi ( Ruiz et al , 1999 ; Mimeaultet al , 2003 ) o l’arresto del ciclo cellulare ( Sarfaraz et al , 2006 ). Il coinvolgimento dei recettori dei cannabinoidi a tali effetti è incerta come CB ₁ antagonisti bloccati effetti citotossici in tempi di incubazione brevi ( Mimeault et al , 2003 ; Sarfaraz et al , 2005 ), anche se vi è stata una mancanza di effetto ad una durata più lunga ( Ruiz et al , 1999 ; Mimeault et al , 2003 ).

In questo studio, abbiamo analizzato il ruolo della BC ₂ recettore androgeno nella linea cellulare resistente prostata, PC-3, che rappresenta la fase androgeno-refrattario del carcinoma della prostata avanzato. Abbiamo usato l’analogo anandamide, R (+) Methanandamide (TEM), per il confronto con risultati precedenti, ed un potente e selettivo CB ₂ agonista, JWH-015 (JWH), nonché CB ₂ antagonisti ed silenziamento dell’RNA che mostra l’ ruolo di CB ₂ in cellule PC-3.

Reagenti

R (+)-Metanandamide, JWH-015 [(2-metil-1-propil-1 H -indol-3-il)-1-naphtalenylmethanone] e fumonisina B1 sono stati acquistati dalla Sigma (St. Louis, MO, USA). SR 144528 (SR2) è stato gentilmente fornito da Sanofi Recherche (Montpellier, Francia). Anticorpo anti-CB₂ recettori è stato ottenuto da Affinity BioReagents (Golden, CO, USA). Abbiamo acquistato anti-tubulina, anti-fosfo Akt a ser473, anti-fosfo p38, anti-totale p38, anti-fosfo JNK, JNK anti-totale, anti-fosforo eIF2 α , anti-caspasi 8 e anti-caspasi 9 e anti -citocromo c anticorpi da Cell Signaling Technology (St Louis, MO, USA). L’inibitore D609 e il diacilglicerolo chinasi sono stati forniti dalla Calbiochem (La Jolla, CA, USA).

Colture cellulari

Umana prostata epiteliale PC-3, DU-145 e LNCaP sono stati acquistati da American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) e sono state coltivate in RPMI-1640 medium supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS), 100 U ml ^{– 1} penicillina G, 100 μ g ml ^-1streptomicina e 0,25 μ g ml ^-1 amfotericina B (Invitrogen, Paisley, UK). Passaggi delle cellule bassi (tra 10 e 20) sono stati utilizzati per questo studio. Le cellule sono state seminate sub-confluently e, 1 giorno prima dell’esperimento, il siero è stato rimosso per lavorare con cellule quiescenti.

Saggi di vitalità cellulare

Le cellule sono state costituite 2 × 10 ⁴ cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e sono stati coltivati ​​in terreno RPMI 1640 supplementato con 10% FCS. Dopo trattamenti secondo la figura legende, la vitalità cellulare è stata saggiata mediante MTT come precedentemente descritto ( Sanchez et al , 2003 ).

Citometria a flusso

Citometria di flusso è stata utilizzata per rilevare le cellule apoptotiche e la distribuzione del ciclo cellulare. Dopo essere stato coltivato a solo terreno o mezzo contenente gli stimoli indicati, 10 ⁵ cellule in un piatto di coltura da 35 mm sia stato tagliato 0,1% Nonidet P-40 e 0,5 mg ml^-1 RNasi per 30 min e colorati con 0,05 mg ml ^-1 iodure propidio (PI) per indicare il contenuto di DNA relativa. Il picco sub-G1 (contenuto di DNA <2 N) e la distribuzione del ciclo cellulare sono stati misurati utilizzando citofluorimetro FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Per analizzare l’apoptosi annessina V colorazione, le cellule sono state lavate due volte con PBS e incubati in 0,5 ml di tampone di legame (10 m m HEPES pH 7,4, 150 m m NaCl, 2,5 m m CaCl ₂ , 1 m m MgCl ₂ e il 4% BSA), con 4 μ g ml ^-1 annessina V-FITC per 15 min. Le cellule sono state quindi lavate in PBS e risospese nel tampone di legame con 0,6 μ g ml ^-1 IP (Calbiochem). In tutto, 20 000 cellule di ciascun campione sono state analizzate mediante citometria di flusso in un FACScan (Beckton Dickinson).

Misurazione di [ ³ H]-timidina nel DNA

Cellule sono state trattate con differenti concentrazioni di TEM o JWH-015 secondo l’esperimento. Sintesi di DNA è stato determinato facendo pulsare le cellule con [ ³H]-timidina (1 μ Ci per pozzetto) durante gli ultimi 16 h del periodo di coltura come precedentemente descritto ( Sanchez et al , 2003 ).

tranfections siRNA

Le cellule sono state trasfettate in 1 ml Optimati contenente 4 μ g lipofectamina 2000 (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA), con 100 n m cannabinoidi umano del recettore-2-specifici piccoli RNA interferenti (siRNA) duplex (5′-GGCCUCUUCCCAAUUUAAAtt-3 ‘, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) o il controllo strapazzate RNA per 12 h secondo i protocolli del produttore (Ambion, Applied Biosystems). A 24 ore dopo la trasfezione, il mezzo è stato rimosso e sostituito con RPMI 1640 con 10% FCS medie. A tempi dedicati dalla trasfezione, le cellule sono state utilizzate per i saggi di citometria di flusso o western blot.

Misurazione dei livelli di ceramide

Quantificazione ceramide in estratti cellulari lipidi è stata eseguita secondo il metodo descritto da Perry et al per la quantificazione ceramide in cellule in coltura ( Perry et al , 2000 ). Brevemente, pellet cellulari sono stati sospesi in 0,6 ml di acqua distillata, e disgregate a 4 ° C per sonicazione. I lipidi sono stati estratti con cloroformio / metanolo, e contenuti ceramide è stata determinata dalla fosforilazione utilizzando Escherichia coli diacilglicerolo chinasi e [ ³² P] γ -ATP (6000 Ci mmol ^-1 ; Perkin-Elmer, Barcellona, ​​Spagna). Prodotti di questa reazione sono stati purificati mediante TLC usando cloroformio-acetone-metanolo-acido acetico-acqua (50 : 20 : 15 : 10 : 5 in volume) come solvente di sviluppo. Prodotti di questa reazione sono stati quantificati ed espressi come percentuale del valore osservato in precedenza ( Sanchez et al , 2007 ).

Le analisi Western blot

Cellule in coltura sono state lisate in un tampone di lisi (50 m m Tris-HCl, pH 7,4, 5 m m EDTA, 1 m m EGTA, 10 m m 2-mercaptoetanolo) contenente il 5 μ g ml ^-1 leupeptina, 5 μ gml ^{– 1} aprotinin e 1 m m PMSF, e sono stati interrotti per sonicazione. La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando il saggio di proteine ​​Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).Western blotting è stata effettuata come descritto in precedenza ( Sanchez et al , 2006 ).

In vivo attività antitumorale

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con la normativa istituzionale spagnolo per la custodia, la cura e l’uso di animali da esperimento, sono stati effettuati con l’approvazione del comitato etico e il rispetto delle direttive comunitarie che regolano la ricerca sugli animali. Raccomandazioni formulate dal UKCCCR sono state rispettate con attenzione.Atimico nude (nu / nu) 6 settimane di età topi maschi sono stati acquistati dalla Harlan Iberica (Barcellona, ​​Spagna) e sono stati alloggiati in un armadio di flusso d’aria laminare in condizioni esenti da organismi patogeni su un 12-h calendario chiaro-scuro. I topi sono stati iniettati per via sottocutanea (sc) nel fianco destro con 2 × 10 ⁶ cellule PC-3 in 0,2 ml di terreno di coltura completo. Due settimane dopo il trapianto, i tumori erano cresciuti a un volume medio di 70 mm ³ . I topi sono stati poi divisi in tre gruppi sperimentali di otto animali ciascuno, che hanno ricevuto i seguenti trattamenti come iniezioni sc: gruppo A, soluzione salina (controllo); gruppo B, 0,15 mg kg ^-1 di peso corporeo (pc) JWH-015, gruppo C, 0,15 mg kg ^-1 di peso corporeo JWH-015, più 0,15 mg kg ^-1 di peso corporeo SR2.L’iniezione è stata ripetuta è stato continuato tutti i giorni e il trattamento per 14 giorni. Volumi tumorali sono stati monitorati ogni giorno utilizzando le misurazioni della pinza e sono stati calcolati utilizzando la seguente formula: (4 π / 3) × ( w / 2) ² × ( l / 2), dove w = larghezza e l = lunghezza. Il peso corporeo degli animali è stata registrata quotidianamente.

L’analisi statistica

I dati sono presentati come media ± SE il numero di esperimenti indicato. Confronti statistici tra i gruppi sono state fatte con Student t -test, e la differenza è stato considerato statisticamente significativo quando il P -value è <0.05.

I cannabinoidi, ha incontrato e JWH-015, hanno inibito la crescita delle cellule di cellule tumorali della prostata

Abbiamo prima esaminato gli effetti antiproliferativi della anandamide analogico stabile, ha incontrato, e il sintetico CB ₂ ligando, JWH-015, sulla prostata cellule PC-3. La cinetica di MET e JWH-015 trattamento hanno dimostrato che la morte cellulare indotto dai cannabinoidi era evidente da 12 ore, anche se l’effetto massimo è stato raggiunto a 48-72 h ( Figura 1A ). Così, abbiamo deciso di seguire tutti gli studi a 48 h. Le cellule sono state incubate in presenza di concentrazioni crescenti di TEM o JWH-015 per 48 ore, dopo di che la vitalità cellulare è stata valutata mediante saggio MTT, [ ³ H]-timidina saggio di incorporazione o mediante citometria a flusso. Come mostrato nella Figura 1B , sia MET e JWH-015 ha causato una riduzione dose-dipendente della vitalità delle cellule, che era significativamente diverso dal controllo da dosi oltre 5 μ m . Per valutare gli effetti soppressivi di R (+)-Methanandamide e JWH-015 sulla proliferazione di cellule PC-3, sintesi di DNA è stata misurata con [ ³H]-timidina. Risultati mostrati in Figura 1C indicano che entrambi i cannabinoidi inibiscono la proliferazione di cellule PC-3, che è stato completamente bloccato da dosi oltre 5 μ m . L’analisi del ciclo cellulare dimostrato che il trattamento cannabinoidi determinato una piccola, pur significativo accumulo di cellule nella fase sub-G1 del ciclo cellulare ( Figura 1D ). Questi risultati suggeriscono che i composti utilizzati indotto una piccola percentuale di apoptosi e arresto della crescita nelle cellule della prostata. Per verificare se l’effetto antiproliferativo dei cannabinoidi su cellule tumorali della prostata è stato generalizzato, abbiamo usato le androgeno-refrattario cancro alla prostata DU-145 cellule e le androgeno-dipendenti della prostata LNCaP meno tumori. Risultati mostrati in Figura 2 hanno dimostrato che sia MET e JWH-015 inibito la crescita delle tre linee tumorali studiate prostata, anche se l’effetto era meno pronunciato nelle cellule LNCaP androgeno-sensibili. Come mostrato in Figura 2A , basse dosi (sub-micromolare) del TEM ha indotto un leggero aumento della vitalità cellulare LNCaP, come precedentemente riportato dal nostro gruppo ( Sanchez et al , 2003 ).

 

Figura 1

L’effetto anti-proliferativo dei cannabinoidi, R (+)-Methanandamide e JWH-015, sulla prostata cellule PC-3. ( A ) Naturalmente il tempo di effetto dei cannabinoidi sulla prostata PC-3 celle vitalità. PC-3 cellule sono state incubate con 10 μ m TEM o 10  …

 

Figura 2

Effetto antiproliferativo dei cannabinoidi su diverse linee cellulari di cancro della prostata. ( A ) Il cancro alla prostata LNCaP, PC-3 e DU-145 cellule sono state incubate con diverse dosi di TEM per 48 ore e la vitalità cellulare è stata valutata mediante MTT. ( B ) Il cancro alla prostata LNCaP, …

Per quantificare la percentuale di cellule apoptotiche dopo trattamenti farmacologici, cellule PC-3 sono state colorate con annessina V-FITC/IP. I risultati mostrano che la percentuale di cellule apoptotiche in ritardo (annessina V-FITC positivo / IP positivo, quadrante superiore destro) in MET-e JWH-015 trattati con cellule era statisticamente aumentato rispetto a quello in cellule di controllo ( Figura 3 ). R (+) Methanandamide e JWH-15 trattamenti anche indotto necrosi cellulare, come si evince dalle cellule IP-positive (quadrante in alto a sinistra). Cellule in apoptosi precoce (annessina V-FITC positivo / negativo IP, quadrante inferiore destro) erano <5% in tutti i casi. Questi risultati indicano che sia MET e JWH-015 promosso un basso, anche se significativa, percentuale di apoptosi nelle cellule tumorali della prostata, ma altri processi come mitotico catastrofe, citotossicità o necrosi potrebbero anche collaborare alla inibizione della crescita osservata.

 

Figura 3

Valutazione della apoptosi Annessina V-FITC/IP colorazione, seguita da analisi di citometria a flusso. Sono mostrati trame rappresentativi di annessina V-FITC/IP colorazione delle cellule PC-3 coltivate in presenza di concentrazioni crescenti di TEM o JWH-015. Dati che mostrano …

Coinvolgimento dei CB ₂ in effetto antiproliferativo dei cannabinoidi

Come abbiamo precedentemente indicato, prostata PC-3 cellule esprimono sia CB ₁ e CB ₂ recettori dei cannabinoidi (Sanchez et al , 2003 ). Abbiamo quindi studiato il ruolo di CB ₁ e CB ₂ nella morte delle cellule della prostata indotto dai cannabinoidi. Blocco farmacologico del CB ₁ con il suo antagonista Rimonabant (SR1) non ha ridotto l’effetto di MET su ciclo cellulare o apoptosi ( Figura 4A ). Tuttavia, la CB ₂antagonista, SR 144528 (SR2), ha ridotto il numero di cellule apoptotiche e il numero di cellule sub-G1 indotti dal trattamento MET ( Figura 4A ). Come MET è un legante debole per CB ₂ , abbiamo confermato questo risultato con il CB ₂ agonista selettivo JWH-015. L’effetto JWH-015-indotta morte cellulare è invertita da SR2, suggerendo un ruolo per CB ₂ nei meccanismi apoptotici dei cannabinoidi in cellule PC-3.

 

Figura 4

L’inibizione della morte cellulare indotto dai cannabinoidi dal CB ₂antagonista, SR 144528 (SR2). PC-3 le cellule sono state incubate con 10 μ m incontrato o 10 μ m JWH-015 per 48 ore in presenza o assenza di 0,5 μ m Rimonabant  …

Per confermare il coinvolgimento di CB _2, noi tacere la sua espressione con siRNA. PC-3 cellule sono state trasfettate con CB ₂ siRNA o controllo selettivo scrambled RNA per 48 ore, dopo di che l’espressione della BC ₂ è stata notevolmente ridotta come è stata confermata mediante Western blotting ( figura 5 ). In queste condizioni, l’apoptosi indotta da 10 μ m JWH-015 è stata quasi totalmente bloccato in cellule trasfettate con CB ₂ siRNA se confrontato con scrambled siRNA cellule transfettate ( Figura 5). Questi risultati confermano il coinvolgimento della BC ₂ recettore nel effetto pro-apoptotico dei cannabinoidi in cellule della prostata. Pertanto, abbiamo condotto il resto degli esperimenti con JWH-015, che è un potente e selettivo ligando per CB ₂ e che espone più efficacia che soddisfatto per CB ₂attivazione.

 

Figura 5

CB ₂ è coinvolto nella effetto anti-proliferativo di JWH-015 in cellule PC-3. Le cellule sono state trasfettate con CB ₂ -specifico piccoli RNA interferenti (siRNA) o con controllo RNA scrambled per 48 he poi trattati con 10 μ m JWH-015 per un  …

Sintesi di ceramide media l’effetto anti-proliferativo indotto da CB ₂ attivazione

Ceramide è un messaggero sphingolipid che ha un ruolo importante nella regolazione del destino delle cellule tumorali (Velasco et al , 2005 ; Carpinteiro et al , 2008 ). Studi recenti hanno suggerito che l’apoptosi indotta da cannabinoidi può essere preceduto da accumulo di ceramide ( Gomez del Pulgar et al , 2002 ;Gustafsson et al , 2006 ). Per analizzare ulteriormente il meccanismo apoptotico di JWH-015, abbiamo misurato la concentrazione intracellulare di ceramide in cellule PC-3. Come mostrato in Figura 6A , l’incubazione con JWH-015 per 48 ore ha portato ad un aumento dose-dipendente della ceramide accumulo intracellulare. Questo effetto è stato impedito dal CB ₂ antagonista SR2, il che indica che l’accumulo di ceramide era mediata dall’attivazione della BC ₂ ( Figura 6B ). Ceramide è formato in membrane cellulari da de novo sintesi attraverso un percorso che coinvolge la ceramide sintasi o mediante idrolisi di sfingomielina catalizzata da acido, neutro e sfingomielinasi alcalina. Al fine di conoscere l’origine di aumento ceramide JWH-015-indotta, le cellule sono state incubate in presenza dell’inibitore ceramide sintasi, Fumonisina B1, o l’inibitore sfingomielinasi, D609. Come mostrato in figura 6B , il trattamento delle cellule con 10 μ m Fumonisina B1, ma non con D609, impedito l’aumento della concentrazione di ceramide, un fatto che suggerisce che ceramide proveniva da de novo biosintesi.

 

Figura 6

Coinvolgimento della sintesi di ceramide nella inibizione della crescita cellulare JWH-015-indotta. ( A ) cellule PC-3 sono state incubate in presenza di concentrazioni crescenti di JWH-015 per 48 he ceramide intracellulare è stata misurata mediante il metodo chinasi DAG come indicato …

Inoltre, il trattamento con Fumonisina B1 impedito l’inibizione della crescita cellulare indotta da JWH-015 ( figura 6C ), indicando che ceramide è stato coinvolto nella biosintesi l’azione del cannabinoide.

Meccanismi di segnale coinvolti nella prostata morte delle cellule PC-3 JWH-015-indotta

Per esplorare ulteriormente le vie di segnalazione in cui il CB ₂ agonista esercitata il suo effetto in prostata cellule PC-3, abbiamo studiato allo stress MAP chinasi cascate di attivazione da parte di Western Blot.PC-3 cellule sono state trattate per tempi diversi con 10 μ m JWH-015 e poi forme fosforilate di JNK e p-chinasi, 38 indicativi per chinasi attivate, sono state rilevate mediante western blot. Risultati in figura 7Amostrano che JWH-015 si attiva il segnale di stress-correlati JNK chinasi come JNK fosforilata viene aumentata a 30 min e 1 h di trattamento.

 

Figura 7

Meccanismi di segnalazione attivati ​​da JWH-015 nella prostata cellule PC-3. Le cellule sono state incubate con 10 μ m JWH-015 per tempi diversi. ( A ) i livelli di fosforilazione di p38, JNK, Akt e eIF2 αsono stati misurati mediante Western Blot. ( B ) Livelli di  …

Cellule eucariotiche rispondono a stress nel loro reticolo endoplasmatico fosforilando l’ α -subunità di traslazione iniziazione fattore 2 (eIF2 α ). Questo adattamento inibisce la sintesi proteica generale, promuovendo al contempo di traduzione e di espressione regolatori trascrizionali che inducono l’espressione del gene importante per la bonifica cellulare e l’apoptosi. E ‘stato recentemente descritto che i cannabinoidi promuovono stress del reticolo endoplasmatico e morte cellulare mediata autofagia nelle cellule di glioma tramite la destinazione Akt / mammifero della rapamicina (mTOR) inibizione pathway e eIF2 α attivazione ( Salazar et al , 2009b ). Per studiare se JWH-015 regolate questo percorso in cellule della prostata, abbiamo trattato le cellule con il CB ₂ agonista e misurato la fosforilazione di Akt in ser473, che è coinvolto negativamente nella via autofagia ( Todde et al , 2009 ). PC-3 trattamento con 10 μ m JWH-015 ha determinato un calo nel lungo periodo fosforilazione AKT che era evidente dal 6 ore di trattamento ( Figura 7A ). Ciò era in accordo con l’aumento fosforilato eIF2 α ( Figura 7A ), suggerendo che i segnali di stress reticolo endoplasmatico sono state attivate dalla JWH-015 nelle cellule prostatiche. Abbiamo inoltre studiato se JWH-015 indotta attivazione delle caspasi, che può essere rilevato dopo la diminuzione nella forma pro-caspasi e l’aumento nella forma attiva proteolitica mediante Western blot ( Hoffmann et al , 2009 ). Risultati in Figura 7 mostrano che JWH-015 indotta attivazione della caspasi 9, che è stato descritto come un iniziatore caspasi essenziale nella via intrinseca o mitocondrialmente gated dell’apoptosi ( Johnson e Jarvis, 2004 ; Denault e Salvesen, 2008 ). Per confermare ulteriormente l’attivazione della via apoptotica intrinseca, abbiamo determinato i livelli citosolici di citocromo c , che viene rilasciata nel citosol quando la cellula riceve uno stimolo apoptotico per innescare la morte programmata attraverso caspasi 9 attivazione ( Ow et al , 2008 ).

JWH-015 ha causato una regressione di xenotrapianti tumorali della prostata in topi nudi

Le osservazioni sopra degli effetti antiproliferativi di JWH-015 sono stati esaminati in un modello di xenotrapianto di carcinoma della prostata. Xenotrapianto tumori umani della prostata sono stati istituiti nel nu / nu topi da una iniezione sottocutanea. Animali di tumore-cuscinetto (~ 70 mm ² ) sono stati trattati giornalmente con veicolo, 1,5 mg ml ^-1 JWH-015 o 1,5 mg ml ^-1 JWH-015 più 1,5 mg kg ^-1SR2. Animali sono stati trattati per 15 giorni e il volume del tumore è stato calcolato ogni giorno. Alla fine dell’esperimento, i tumori sono stati sezionati e pesati. Come mostrato in Figura 8 , gli animali JWH-015-trattati avevano una riduzione rapida e drammatica della crescita tumorale, mentre la crescita incontrollata è stato osservato nel gruppo di controllo. Il volume del tumore finale e il peso del tumore finale era significativamente inferiore nel gruppo JWH-015-trattato rispetto a quella del gruppo di controllo ( Tabella 1 ). Il trattamento con JWH-015, più SR2 determinato una crescita analoga rispetto a quella del gruppo di controllo, suggerendo che l’ in vivo effetto di JWH-015 è anche mediati da CB ₂ attivazione ( Figura 8 e Tabella 1 ).

 

Figura 8

In vivo le proprietà anti-tumorali di JWH-015. Atimici topi nudi sono state iniettate sc nel fianco destro con cellule PC-3 e 4 settimane dopo (giorno 0) sono stati trattati per 15 giorni con il veicolo (controllo), 1,5 mg kg ^-1 JWH-015 o 1,5 mg kg …

 

 

Tabella 1

Effetto del JWH-015 on-3 PC xenotrapianto crescita tumorale

 

La deregolamentazione dei meccanismi di sopravvivenza delle cellule e la resistenza all’apoptosi sono ampiamente accettato di essere gli aspetti fondamentali della tumorigenesi, come l’evasione di apoptosi può contribuire alla cancerogenesi, progressione del tumore e anche alla resistenza al trattamento.Maggior parte delle attuali terapie antitumorali agiscono attivando percorsi di morte cellulare nel cancro. Una serie di studi hanno di recente messo in luce il ruolo dei membri della famiglia dei cannabinoidi come agenti antitumorali, consentendo il potenziale di sviluppo di trattamenti anti-neoplastica-efficienti.

In questo studio, abbiamo dimostrato che l’anandamide analogico stabile, MET, così come JWH-015, un tipo di recettore cannabinoide agonista 2-selettivo, ha inibito la proliferazione del cancro alla prostata umano PC-3, DU-145 e LNCaP. Il fatto che l’effetto antiproliferativo dei cannabinoidi è stato meno pronunciato nelle cellule LNCaP è in accordo con i risultati precedenti che mostrano una più alta espressione di CB ₂ in PC-3 e DU-145 cellule che in cellule LNCaP ( Sarfaraz et al , 2005 ) e punta a un CB ₂ effetto-mediata. Abbiamo poi dimostrato che CB ₂ è stato coinvolto nella morte delle cellule PC-3 indotto dai cannabinoidi, in quanto bloccando la sua attivazione con un antagonista specifico (SR2) quasi totalmente impedito la morte cellulare dopo incubazione delle cellule con MET e JWH-015. Il ruolo dei CB ₂ recettori nella effetto anti-proliferativo dei cannabinoidi è ulteriormente supportato da risultati ottenuti abbattendo CB ₂ mRNA con l’uso di siRNA selettiva. Vi è ora un ampio corpus di dati che indicano che il recettore dei cannabinoidi di tipo 2 è legata a varie risposte legate alla proliferazione, la differenziazione e la sopravvivenza di molti tipi di cellule ( Fernandez-Ruiz et al , 2007 ; Svizenska et al , 2008 ). Le nostre osservazioni sono coerenti con precedenti dimostrano che CB ₂ stimolazione del recettore cannabinoide è coinvolto in attività antitumorale in vitro e in topi inoculati con xenotrapianti di tumori in vivo ( Caffarel et al , 2006 ; Carracedo et al , 2006a ; Fernandez-Ruiz et al , 2007 ). Come precedentemente proposto, questo recettore può funzionare come un segnale di favorire un non differenziata, proliferano stato di cellule ( Fernandez-Ruiz et al , 2007 ). In linea con questo concetto, aumento dei livelli di CB ₂ è stato dimostrato in cellule di cancro alla prostata rispetto al normale prostata ( Sarfaraz et al , 2008 ), e una correlazione tra CB ₂ è stato osservato anche espressione e il grado istologico dei tumori al seno ( Caffarel et al , 2006 ). L’attivazione del CB ₂ recettori induce l’apoptosi e riduce la crescita tumorale di glioma ( Sanchez et al , 2001 ; Blazquez et al , 2008 ), il carcinoma del pancreas ( Carracedo et al , 2006a ) o il cancro al seno ( Caffarel et al , 2006 ). Inoltre, una recente ricerca dimostra che l’azione anti-tumorale di agonisti dei recettori dei cannabinoidi nelle cellule tumorali del colon può essere esercitata attraverso il CB ₂ recettori in modo più efficiente che attraverso il CB ₁ recettore ( Cianchi et al , 2008 ), che è coerente con i nostri risultati in cellule della prostata.

I nostri dati mostrano che CB ₂ recettori by JWH-015 nella prostata cellule PC-3 induce de novo sintesi della ceramide, che media l’effetto apoptotico di JWH-015 in quanto l’aggiunta della ceramide sintasi inibitore Fumonisina B1 impedito l’induzione di apoptosi . Ceramide è un secondo messaggero che ha dimostrato di agire come un mediatore lipidico pro-apoptotica di azione cannabinoidi ( Guzman et al , 2001 ). È stato precedentemente descritto che, sebbene CB ₁ recettore attivazione induce aumento ceramide acuto tramite idrolisi della sfingomielina ( Sanchez et al , 1998 ), sostenuta attraverso un maggiore accumulo di ceramide de novo sintesi sembra esercitare un effetto importante in CB ₂ indotta apoptosi ( Gomez del Pulgar et al , 2002 ; Herrera et al , 2006 ; Carracedo et al , 2006a ; Cianchi et al , 2008 ), che è in buon accordo con i nostri dati. Molti farmaci antitumorali anche indurre la morte, stimolando la produzione di ceramide ( Claria, 2006 ; Lin et al , 2006 ). Media ceramide l’apoptosi di radioterapia ( Moeller et al , 2009 ), e l’attenuazione dei livelli di ceramide conferisce resistenza alle radiazioni in cellule tumorali della prostata ( Mahdy et al , 2009 ). Ceramide ha dimostrato di attivare un numero di enzimi coinvolti nella sollecitazione cascate di segnalazione, incluse proteine ​​chinasi attivate da stress, come gli Giugno chinasi JNK, che sono coinvolti nella induzione di apoptosi ceramide-mediata ( Ruvolo, 2003 ). I nostri dati dimostrano che il JWH-015 attiva JNK in cellule della prostata, che è in accordo con i risultati precedenti che mostrano un CB ₂ attivazione di JNK-dipendente in cellule microgliali ( Correa et al , 2009 ) e nelle cellule epiteliali polmonari ( Sarafian et al , 2008 ). Questo studio ha anche dimostrato che il JWH-015 inibisce la via Akt-mTOR e attiva eIF2 α, che sono coinvolti nella regolazione dell’autofagia e reticolo endoplasmatico risposta allo stress, suggerendo che queste vie sono coinvolti nella morte cellulare JWH-015-indotta della prostata. Il rilascio di fattori pro-apoptotici quali citocromo c dai mitocondri conduce alla formazione di un complesso multimerico noto come apoptosoma e avvia cascate attivazione delle caspasi. Il fatto che JWH-015 indotta citocromo c rilascio nel citosol e caspasi 9 nella prostata cellule PC-3 conferma il coinvolgimento dell’apoptosi e punti ad una attivazione della via apoptotica intrinseca. Una migliore comprensione dei meccanismi a valle di morte cellulare indotta da prostata cannabinoidi in cellule prostatiche offrirebbe nuove opportunità per lo sviluppo di una terapia di combinazione nel trattamento del cancro della prostata. Complessivamente, i nostri dati mostrano un ruolo per il recettore cannabinoide CB ₂ nella effetto antitumorale dei cannabinoidi sulle cellule della prostata in vitro e in vivo . C’è un notevole interesse per l’applicazione delle selettivi CB ₂ agonisti dei recettori, che sono privi di tipico marijuana-come le proprietà psicoattive di CB ₁ agonisti, per le future terapie antitumorali a base di cannabinoidi. Pertanto, il nostro punto per la potenziale applicazione del recettore dei cannabinoidi di tipo 2 ligandi come agenti anti-tumorali nel cancro della prostata risultati.

 

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministerio de Ciencia e Innovación (Grant SAF2008-03220), Comunidad de Madrid (Grants CAM / UAH CCG08-UAH/BIO-3914 e CAM S-SAL-0261-2006) e la Comunidad Castilla-LaMancha (Grant PII1 / 09-0165-0822). SM-C riceve una borsa di studio del programma di Juan de la Cierva dal MEC spagnolo. NO-H e DV ricevono borse di studio presso l’Università di Alcalá.

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Articoli dal British Journal of Cancer sono forniti qui per gentile concessione di Cancer Research UK