Scoperti due nuovi fitocannabinoidi: il Δ9-Tetraidrocannabiphorol (THCP) ed il Cannabidiphorol (CBDP)

La ricerca, rivoluzionaria ed innovativa, è stata svolta dai seguenti ricercatori:

ed è stata riportata sul sito https://doi.org/10.1038/s41598-019-56785-1 e Nature.com

Qui puoi scaricare il PDF originale (in lingua inglese): https://www.nature.com/articles/s41598-019-56785-1.pdf

Di seguito riportiamo l’intera ricerca originale tradotta in Italiano, secondo i termini della licenza Creative Commons CC BY.

DATI FINALI DA TENERE IN CONSIDERAZIONE

Nel presente lavoro, riportiamo per la prima volta l’isolamento e la piena caratterizzazione di due nuovi omologhi eptyl di CBD e Δ 9 -THC, che abbiamo chiamato cannabidiphorol (CBDP) e Δ 9 -tetrahydrocannabiphorol (Δ 9-THCP), rispettivamente. Questi nomi comuni derivavano dalla tradizionale denominazione dei fitocannabinoidi basata sul residuo resorcinilico, in questo caso corrispondente allo sferoforolo.

I risultati biologici ottenuti nel test di legame in vitro hanno indicato un’affinità per il recettore CB 1 superiore di oltre trenta volte rispetto a quella riportata per Δ 9 -THC in letteratura 14 . Inoltre, questi dati incoraggianti sono stati supportati dalla valutazione in vivo dell’attività cannabimimetica mediante il test tetrado , in cui Δ 9- THCP ha ridotto l’attività locomotoria e la temperatura rettale, indotto la calepsia e prodotto analgesia mimando le proprietà degli agonisti del recettore CB 1 completi (Fig.  4 ). In particolare, Δ 9 -THCP si è dimostrato attivo quanto Δ 9-THC ma a dosi più basse. In effetti, la dose minima di THC utilizzata in questo tipo di test è di 10 mg / kg, mentre Δ 9- THCP risultava attivo a 5 mg / kg in tre dei quattro test di tetrad. Questi risultati, accompagnati dai dati di docking, sono in linea con gli studi approfonditi sulla relazione struttura-attività (SAR) condotti nel corso degli anni sui cannabinoidi sintetici, rivelando l’importanza della lunghezza della catena alchilica in posizione 3 sulla porzione resorcinilica nella modulazione l’affinità del ligando al recettore CB 1 .

LO STUDIO COMPLETO – VERSIONE INTEGRALE

Astratto

(-) – Trans -Δ 9- tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC) è il principale composto responsabile dell’attività tossica della Cannabis sativa L. La lunghezza della catena alchilica laterale influenza l’attività biologica di questo cannabinoide. In particolare, analoghi sintetici di Δ 9- THC con una catena laterale più lunga hanno mostrato proprietà cannabimimetiche molto superiori a Δ 9 -THC stesso. Nel tentativo di definire il profilo dei fitocannabinoidi che caratterizza una varietà di cannabis medicinale, un nuovo fitocannabinoide con la stessa struttura di Δ 9-THC ma con una catena laterale alchilica a sette termini è stata identificata. Il composto naturale è stato isolato e completamente caratterizzato e la sua configurazione stereochimica è stata assegnata per corrispondenza con lo stesso composto ottenuto da una sintesi stereoselettiva. Questo nuovo fitocannabinoide è stato chiamato (-) – trans -Δ 9 -tetraidrocannabiphorol (Δ 9 -THCP). Insieme a Δ 9- THCP, anche l’omologo corrispondente del cannabidiolo (CBD) con catena alchilica a sette termini (CBDP) è stato isolato e identificato in modo univoco dalla corrispondenza con la sua controparte sintetica. L’attività di legame di Δ 9- THCP contro il recettore CB 1 umano in vitro (K i = 1,2 nM) è risultato simile a quello di CP55940 (K i  = 0,9 nM), un potente agonista CB 1 completo . Nel test farmacologico tetradico dei cannabinoidi, Δ 9- THCP ha indotto ipomotilità, analgesia, catalepsia e diminuzione della temperatura rettale che indica un’attività cannabimimetica simile al THC. La presenza di questo nuovo fitocannabinoide potrebbe spiegare le proprietà farmacologiche di alcune varietà di cannabis difficili da spiegare per la presenza della suola Δ 9 -THC.

introduzione

La cannabis sativa è sempre stata una pianta controversa in quanto può essere considerata un salvagente per diverse patologie tra cui il glaucoma 1 e l’epilessia 2 , una preziosa fonte di nutrienti 3 , una materia prima ecologica per la produzione di 4 e tessuti 5 , ma è anche la la droga illecita più diffusa nel mondo, in particolare tra i giovani adulti 6 .

La sua peculiarità è la capacità di produrre una classe di molecole organiche chiamate fitocannabinoidi, che derivano da una reazione enzimatica tra un resorcinolo e un gruppo isoprenoide. La modularità di queste due parti è la chiave per l’estrema variabilità del prodotto risultante che ha portato a quasi 150 diversi fitocannabinoidi noti 7 . I precursori dei fitocannabinoidi più comunemente presenti in natura sono l’acido olivetolico e il pirofosfato di geranile, che prendono parte a una reazione di condensazione che porta alla formazione di acido cannabigerolico (CBGA). Il CBGA può quindi essere convertito in acido tetraidrocannabinolico (THCA) o acido cannabidiolico (CBDA) o acido cannabicromenico (CBCA) mediante l’azione di un enzima ciclasi specifico 7. Tutti i fitocannabinoidi sono biosintesi nella forma carbossilata, che può essere convertita nella forma decarbossilata corrispondente (o neutra) mediante il calore 8 . I cannabinoidi neutri più noti sono senza dubbio Δ 9- tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC) e cannabidiolo (CBD), il primo responsabile delle proprietà intossicanti della pianta di cannabis e il secondo attivo come antiossidante, antinfiammatorio, anti- convulso, ma anche come antagonista degli effetti negativi del THC 9 .

Tutti questi cannabinoidi sono caratterizzati dalla presenza di una catena laterale alchilica sulla porzione resorcinilica composta da cinque atomi di carbonio. Tuttavia, sono noti altri fitocannabinoidi con un diverso numero di atomi di carbonio sulla catena laterale e sono stati chiamati varinoidi (con tre atomi di carbonio), come cannabidivarin (CBDV) e Δ 9 -tetrahydrocannabivarin (Δ 9 -THCV) e orcinoidi (con un atomo di carbonio), come cannabidiorcol (CBD-C 1 ) e tetraidrocannabiorcol (THC-C 1 ) 7 . Entrambe le serie sono biosintetizzate nella pianta poiché sono state identificate le specifiche sintasi chetidiche 10 .

Il nostro gruppo di ricerca ha recentemente segnalato la presenza di una serie di butilfitocannabinoidi con una catena alchilica a quattro termini, in particolare cannabidibutolo (CBDB) e Δ 9 -tetraidrocannabutolo (Δ 9 -THCB), in campioni di CBD derivati ​​dalla canapa e in una cannabis medicinale varietà 11 , 12 . Poiché non è stata fornita alcuna prova della presenza di enzimi vegetali responsabili della biosintesi di questi butil fitocannabinoidi, è stato suggerito che potrebbero derivare dall’ossidazione microbica di ω e dalla decarbossilazione dei corrispondenti omologhi a cinque termini 13 .

La lunghezza della catena laterale alchilica si è infatti rivelata il parametro chiave, il farmacoforo, per l’attività biologica esercitata da Δ 9 -THC sul recettore dei cannabinoidi umani CB 1 come evidenziato da studi di relazione struttura-attività (SAR) raccolti da Bow e Rimondi 14 . In particolare, sono necessari almeno tre carboni per legare il recettore, quindi l’attività più elevata è stata registrata con una catena laterale a otto atomi di carbonio per diminuire infine con un numero maggiore di atomi di carbonio 14 . Gli omologhi Δ 8 -THC con più di cinque atomi di carbonio sulla catena laterale sono stati prodotti e testati sinteticamente per avere molecole più volte più potenti di Δ 9 -THC 1516 .

Per quanto ne sappiamo, un fitocannabinoide con una catena laterale alchilica contenente più di cinque atomi di carbonio non è mai stato riportato come naturale. Tuttavia, il nostro gruppo di ricerca ha rivelato per la prima volta la presenza di omologhi a sette termini di CBD e Δ 9-THC in una varietà di cannabis medicinale, la FM2 italiana, fornita dall’Istituto Chimico Chimico Militare di Firenze. I due nuovi fitocannabinoidi sono stati isolati e completamente caratterizzati e la loro configurazione assoluta è stata confermata da una sintesi stereoselettiva. Secondo il nome internazionale non proprietario (INN), abbiamo suggerito per questi analoghi CBD e THC il nome “cannabidiphorol” (CBDP) e “tetrahydrocannabiphorol” (THCP), rispettivamente. Il suffisso “-forolo” deriva da “sphaerophorol”, nome comune per 5-eptil-benzen-1,3-diolo, che costituisce la porzione resorcinilica di questi due nuovi fitocannabinoidi.

Numerosi studi clinici 17 , 18 , 19 e un crescente corpus di letteratura forniscono prove concrete del potenziale farmacologico della cannabis e dei cannabinoidi su una vasta gamma di disturbi dal sonno all’ansia, alla sclerosi multipla, all’autismo e al dolore neuropatico 20 , 21 , 22 , 23 . In particolare, essendo il cannabinoide psicotropico più potente, Δ 9- THC è l’obiettivo principale di tali studi. Alla luce di quanto sopra e dei risultati degli studi SAR 14 , 15 , 16 , ci aspettavamo che il THCP fosse dotato di un’affinità di legame ancora più elevata per CB 1recettore e una maggiore attività cannabimimetica del THC stesso. Al fine di studiare questi aspetti farmacologici del THCP, la sua affinità di legame per il recettore CB 1 è stata testata con un test in vitro con radioligando e la sua attività cannabimimetica è stata valutata mediante test comportamentali tetradi nei topi.

risultati

Identificazione di cannabidiphorol (CBDP) e Δ 9 -tetraidrocannabiphorol (Δ 9 -THCP) mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS)

L’estratto etanolico FM2 è stato analizzato con un metodo analitico recentemente sviluppato per la profilazione dei cannabinoidi di questa varietà di cannabis medicinale 12 , 24 . Poiché l’estratto nativo contiene principalmente le forme carbossilate di fitocannabinoidi a seguito di un’estrazione a freddo 25 , parte del materiale vegetale è stata riscaldata per ottenere la decarbossilazione in cui le forme predominanti sono i fitocannabinoidi neutri. La piattaforma analitica avanzata di cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa Orbitrap ad alta risoluzione è stata impiegata per analizzare gli estratti di FM2 e studiare gli spettri di frammentazione degli analiti in esame. Gli ioni precursori dei derivati ​​neutri cannabidiphorol (CBDP) e Δ 9-tetraidrocannabiforolo (Δ 9 -THCP), 341.2486 per [MH]  e 343.2632 per [M + H] + , hanno mostrato un tempo di eluizione di 19,4 min per CBDP e 21,3 min per Δ 9 -THCP (Fig.  1a ). La loro identificazione è stata confermata dall’iniezione di una miscela (5 ng / mL) dei due CBDP sintetizzati chimicamente e Δ 9 -THCP (Fig.  1b ) come verrà descritto in seguito. Per quanto riguarda la loro controparte carbossilata, gli ioni precursori del neutro formano CBDP e Δ 9 -THCP si rompono allo stesso modo in modalità ESI +, ma mostrano un diverso modello di frammentazione in modalità ESI. Mentre Δ 9 -THCP mostra solo lo ione precursore [MH] (Fig.  1d ), la molecola CBDP genera i frammenti in m / z 273.1858 corrispondenti a una reazione di Diels-Alder retro e 207.1381 corrispondenti alla porzione resorcinil dopo la rottura del legame con il gruppo terpenoide (Fig.  1c ). È interessante notare che per entrambe le molecole, CBDP e Δ 9- THCP, ciascun frammento in entrambe le modalità di ionizzazione differisce esattamente per un’unità di etilene (CH 2 ) 2 dai corrispondenti omologhi a cinque termini CBD e THC. Inoltre, il tempo di eluizione più lungo conferma l’ipotesi dei fitocannabinoidi a sette termini considerando la maggiore lipofilia di quest’ultimo.

Figura 1
Figura 1

Isolamento e caratterizzazione di CBDP naturale e Δ 9 -THCP

Al fine di ottenere selettivamente una frazione ricca di cannabinoidi di FM2, è stato usato n- esano per estrarre la materia prima invece dell’etanolo, che trasporta altri contaminanti come flavonoidi e clorofille insieme ai cannabinoidi 26 . Per ottenere un estratto puro di cannabinoidi era necessario un ulteriore stadio di deparaffinazione a -20 ° C per 48 ore e la rimozione della cera precipitata. Cromatografia liquida semi-preparativa con una C 18la fase stazionaria ha permesso la separazione di 80 frazioni, che sono state analizzate da LC-HRMS con il metodo precedentemente descritto. In questo modo, le frazioni contenenti prevalentemente acido cannabidiforolico (CBDPA) e acido tetraidrocannabipgorolico (THCPA) sono state separatamente soggette a riscaldamento a 120 ° C per 2 ore al fine di ottenere le corrispondenti controparti neutre CBDP e Δ 9 -THCP come oli chiari con un > 95% di purezza. Il materiale ottenuto era sufficiente per una completa caratterizzazione di 1 H e 13 C NMR, dicroismo circolare (CD) e assorbimento UV.

Sintesi stereoselettiva di CBDP e Δ 9 -THCP

(-) – trans -Cannabidiphorol ((-) – trans -CBDP) e (-) – trans -Δ 9 -tetrahydrocannabiphorol ((-) – trans -Δ 9 -THCP) sono stati sintetizzati stereoselettivamente come precedentemente riportato per la sintesi di ( -) – trans -CBDB e (-) – trans -Δ 9 -THCB omologhi 11 , 12 , 24 . Di conseguenza, (-) – trans- CBDP è stato preparato per condensazione di 5-eptilbenzene-1,3-diolo con (1  S , 4  R ) -1-metil-4- (prop-1-en-2-il) cicloex -2-enol, usando pTSA come catalizzatore, per 90 min. Il tempo di reazione più lungo non ha migliorato la resa di (-) – trans -CBDP poiché la ciclizzazione di (-) – trans -CBDP a (-) – trans -Δ 9 -THCP e quindi a (-) – trans -Δ 8 -THCP si è verificato. Il 5-eptilbenzene-1,3-diolo è stato prima sintetizzato come riportato nelle Informazioni di supporto (Figura supplementare  SI-1 ). La conversione di (-) – trans -CBDP in (-) – trans -Δ 9 -THCP utilizzando diversi acidi di Lewis, come già riportato in letteratura per la sintesi dell’omologo Δ 9 -THC 27 , 28 , 29, ha portato a una complessa miscela di isomeri che ha provocato un isolamento arduo e a bassa resa di (-) – trans -Δ 9 -THCP mediante tecniche cromatografiche standard. Pertanto, per la sintesi di (-) – trans -Δ 9 -THCP, il suo regioisomero (-) – trans -Δ 8 -THCP è stato prima sintetizzato per condensazione di 5-eptilbenzene-1,3-diolo con (1  S , 4  R ) -1-metil-4- (prop-1-en-2-il) cicloex-2-enolo, come descritto sopra, ma la reazione è stata lasciata in agitazione per 48 ore. In alternativa, (-) – trans -CBDP potrebbe anche essere convertito quantitativamente in (-) – trans -Δ 8-THCP nelle stesse condizioni. L’idroclorurazione del doppio legame Δ 8 di (-) – trans -Δ 8 -THCP, utilizzando ZnCl 2 come catalizzatore, ha permesso di ottenere (-) – trans -HCl-THCP, che è stato successivamente convertito in (-) – trans -Δ 9- THCP in resa dell’87% mediante eliminazione selettiva sulla posizione 2 della porzione terpenica usando t- amilato di potassio come base (Fig.  2a ).

figura 2
figura 2

L’identificazione chimica di sintetico (-) – trans -CBDP e (-) – trans -Δ 9 -THCP, e i loro inequivocabili incarichi 1 H e 13 C sono stati raggiunti dalla spettroscopia NMR (Tabella supplementare  SI-1,2 e Figura complementare.  SI-2,3 ). Poiché (-) – trans -CBDP e (-) – trans -Δ 9 -THCP differiscono dai rispettivi omologhi (CBD, CBDB, CBDV, Δ 9 -THC, Δ 9 -THCB e Δ 9-THCV) esclusivamente per la lunghezza della catena alchilica sulla porzione resorcinilica, non sono state osservate differenze significative nei turni chimici protonici del terpene e nelle porzioni aromatiche per gli omologhi CBD e Δ 9 -THC. La combinazione perfetta nello spostamento chimico del terpene e delle frazioni aromatiche tra i sintetizzati (-) – trans -CBDP e (-) – trans -Δ 9 -THCP e i rispettivi omologhi 11 , 24 , 30 , combinati con gli spettri di massa e modello di frammentazione, ci ha permesso di confermare senza ambiguità le strutture chimiche dei due nuovi cannabinoidi sintetici. Il trans (1 R , 6 R) la configurazione nella porzione terpenica è stata confermata dalla potenza rotatoria ottica. I nuovi cannabinoidi (-) – trans -CBDP e (-) – trans -Δ 9 -THCP hanno mostrato un [α] 20 di −145 ° e −166 °, rispettivamente, in cloroformio. I valori [α] 20 erano in linea con quelli degli omologhi 11 , 31 , suggerendo una configurazione (1 R , 6 R ) sia per CBDP che Δ 9 -THCP. Una perfetta sovrapposizione tra gli spettri 1 H (Fig.  2b, e ) e 13 C NMR (Fig.  2c, f) e l’assorbimento del dicroismo circolare (Fig.  2d, g ) sia sintetico che estratto (-) – trans -CBDP e (-) – trans -Δ 9 -THCP sono stati osservati, confermando l’identità dei due nuovi cannabinoidi identificati nel Varietà di cannabis FM2.

Affinità di legame a CB umano 1 e CB 2 recettori

L’affinità di legame di (-) – trans -Δ 9 -THCP con i recettori CB 1 e CB 2 umani purificati è stata determinata in un saggio di legame radioligando, usando [ 3 H] CP55940 o [ 3 H] WIN 55212-2 come composti di riferimento, e sono state determinate le curve dose-risposta (Fig.  3a, b ). (-) – trans -Δ 9 -THCP si lega con elevata affinità ai recettori CB 1 e CB 2 umani con una i rispettivamente di 1,2 e 6,2 nM. (-) – trans -Δ 9 -THCP è risultato 33 volte più attivo di (-) – trans -Δ9- THC ( i  = 40 nM), 63 volte più attivo di (-) – trans -Δ 9 -THCV ( i = 75,4 nM) e 13 volte più attivo di quello appena scoperto (-) – trans – Δ 9- THCB ( i = 15 nM) contro il recettore CB 12 , 14 . Inoltre, il nuovo identificato (-) – trans -Δ 9 -THCP è risultato da circa 5 a 10 volte più attivo contro il recettore CB 2 ( i = 6.2 nM), in contrasto con (-) – trans -Δ 9 -THC , (-) –trans -Δ 9 -THCB e (-) – trans -Δ 9 -THCV, che ha invece mostrato un’affinità di legame comparabile con un i compreso tra 36 e 63 nM (Fig.  3a ) 12 , 14 .

Figura 3
Figura 3

L’attività più elevata di (-) – trans -Δ 9 -THCP, rispetto agli omologhi più brevi, è stata studiata mediante il calcolo docking. La struttura a raggi X della conformazione attiva del recettore h CB 1 in complesso con l’agonista AM11542 (ID PDB: 5XRA) è stata utilizzata come riferimento per l’attracco poiché sono stati osservati cambiamenti strutturali marcati nel sito legante il ligando ortosterico rispetto alla conformazione del recettore legato ad un antagonista 32 , 33 . AM11542 è un cannabinoide Δ 8 sintetico con elevata affinità contro il recettore h CB 1 ( i = 0,11 nM) che possiede una catena alifatica 7′-bromo-1 ′, 1′-dimetil-eptile a C3 della porzione resorcinilica. Come previsto, a causa della stretta somiglianza chimica, la modalità di legame prevista di (-) – trans -Δ 9 -THCP (Fig.  3c ) riflette quella di AM11542 nella struttura cristallina CB 1 (Fig.  SI-6a, b ) 18 . (-) – trans -Δ 9 -THCP legato nella conformazione attiva di CB 1 in una posa a L. Il tetraidro- 6H-benzo [c] sistema ad anello di cromene si trova all’interno della tasca idrofobica principale delimitata da Phe174, Phe177, Phe189, Lys193, Pro269, Phe170 e Phe268. In particolare, l’anello aromatico della porzione di resorcinile è coinvolto in due interazioni π-π edge-to-face con Phe170 e Phe268, mentre il gruppo idrossilico fenolico in C1 è impegnato in un legame H con Ser383 (Fig.  3c ). È interessante notare che la catena di eptile in C3 si estese in un lungo tunnel idrofobo formato da Leu193, Val196, Tyr275, Iso271, Leu276, Trp279, Leu359, Phe379 e Met363 (Fig.  3c, d ). Perché la posa prevista del sistema di anelli triciclici di tetraidrocannabinolo è conservata tra i quattro omologhi di THC (Figura complementare  SI-7a – c), la lunghezza della catena alchilica a C3 della porzione di resorcinile potrebbe spiegare la diversa affinità di legame osservata tra i quattro cannabinoidi. (-) – trans -Δ 9 -THCP (Fig.  3c ) e (-) – trans -Δ 9 -THC (Supplementary Fig. SI-7a ) condividono lo stesso posizionamento dell’alchile  ‘coda’ all’interno del canale idrofobo 12 , 33 , 34 . Tuttavia, la lunga catena di eptile di Δ 9- THCP è in grado di estendersi nel tunnel per tutta la sua lunghezza, massimizzando le interazioni idrofobiche con i residui del canale laterale. Al contrario, il tunnel è occupato solo parzialmente dalla catena pentile più corta di (-) –trans -Δ 9 -THC, tenendo conto della maggiore affinità di Δ 9 -THCP ( i  = 1,2 nM) rispetto a Δ 9 -THC ( i  = 40 nM). È stato invece previsto un diverso posizionamento della “coda” per gli omologhi a catena alchilica più corta, Δ 9 -THCV e Δ 9 -THCB. La catena propilica e butilica di Δ 9 -THCV e Δ 9 -THCB, rispettivamente, sono troppo corte per estendersi efficacemente all’interno del canale idrofobo. Come affermato nel nostro precedente lavoro 12 , queste catene più corte si adattano all’interno di una piccola tasca idrofobica delimitata da Phe200, Leu359 e Met363 (Figura supplementare  SI-7b, c). Questa tasca laterale si trova nell’inserimento tra la tasca idrofobica principale e il canale lungo (Fig.  3d ) e sembra ospitare piccoli sostituenti idrofobici (gem-dimetil o cicloalchile) introdotti nella posizione C1 della catena laterale di numerosi cannabinoidi sintetici , razionalizzando il notevole miglioramento della potenza e dell’affinità per questi derivati 35 , 36 , 37 , 38 , 39 .

Determinazione in vivo del profilo cannabinoide di Δ 9 -THCP

L’attività dei cannabinoidi di Δ 9- THCP è stata valutata dalla tetrada dei test comportamentali sui topi. La tetrad include la valutazione dell’attività spontanea, l’indice di immobilità (catalepsia), l’analgesia e le variazioni della temperatura rettale. Diminuzione dell’attività locomotoria, catalepsia, analgesia e ipotermia sono segni ben noti di manifestazioni fisiologiche dell’attività dei cannabinoidi 40 . Dopo la somministrazione intraperitoneale (ip), Δ 9 -THCP a 2,5 mg / kg ha ridotto notevolmente l’attività spontanea dei topi in campo aperto, mentre a 5 e 10 mg / kg ha indotto catalepsia sul ring con l’immobilità rispetto al veicolo topi trattati (Fig.  4b, c) (0 mg / kg: 6888 cm ± 474,8, 10 mg / kg: 166,8 cm ± 20,50, 5 mg / kg: 127,5 cm ± 31,32, 2,5 mg / kg: 4072 cm ± 350,8, p = 0,0009). Inoltre, la somministrazione di Δ 9 -THCP ha indotto un aumento significativo, a 10 e 5 mg / kg, della latenza per spostarsi dalla barra di catalepsia (Fig.  4e ) (0 mg / kg: 15,2 sec ± 4,33, 10 mg / kg: 484,5 sec ± 51,58, 5 mg / kg: 493,4 sec ± 35,68, 2,5 mg / kg: 346,1 sec ± 35,24, p = 0,0051). Nel test della piastra riscaldante (Fig.  4f ), Δ 9-THCP (10 e 5 mg / kg) ha indotto un effetto antinocicettivo, mentre a 2,5 mg / kg si è verificata una tendenza all’induzione dell’antinocicezione, che risultava non statisticamente significativa rispetto ai topi trattati con veicolo (0 mg / kg: 19,20 sec ± 2,65, 10 mg / kg: 57,0 secondi ± 2,0, 5 mg / kg: 54,38 secondi ± 2,86, 2,5 mg / kg: 40,22 secondi ± 5,8, p = 0,0044). Δ 9 La somministrazione di THCP ha indotto una riduzione significativa dose-dipendente, solo a 10 mg / kg, della temperatura corporea rispetto al veicolo (0 mg / kg: 0,40 ° C ± 0,25, 10 mg / kg: −7,10 ° C ± 0,43, 5 mg / kg: −5,28 ° C ± 0,36, 2,5 mg / kg: −4,12 ° C ± 0,38, p = 0,0009) (Fig.  4d ).

Figura4
Figura 4

Semi-quantificazione di CBDP e Δ 9 -THCP nell’estratto FM2

Un metodo di semi-quantificazione basato su LC-HRMS ha permesso di fornire una quantità approssimativa dei due nuovi fitocannabinoidi nell’estratto di etanolo FM2. I loro omologhi pentilici , CBD e Δ 9 -THC, hanno mostrato una concentrazione rispettivamente di 56 e 39 mg / g, in conformità con i valori forniti dall’Istituto militare chimico farmaceutico (59 mg / ge 42 mg / g per CBD e Δ 9 -THC rispettivamente), ottenuto con il metodo quantitativo ufficiale GC-FID. Lo stesso metodo semiquantitativo ha fornito una quantità di circa 243 e 29 µg / g rispettivamente per CBDP e Δ 9 -THCP.

Discussione

Fino ad oggi, quasi 150 fitocannabinoidi sono stati rilevati nelle piante di cannabis 7 , 41 , 42 , sebbene la maggior parte di essi non sia stata né isolata né caratterizzata. Il noto CBD e Δ 9 -THC sono stati ampiamente caratterizzati e hanno dimostrato di possedere profili farmacologici interessanti 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , quindi l’attenzione verso l’attività biologica dei loro omologhi noti come CBDV e Δ 9-THCV è recentemente cresciuto, come evidenziato dal crescente numero di pubblicazioni all’anno che appaiono su Scopus. Altri omologhi come quelli appartenenti alla serie orcinoid sono poco studiati probabilmente a causa della loro bassissima quantità nell’impianto che rende il loro isolamento molto impegnativo. Negli ultimi anni, la ricerca sulla genetica agricola ha fatto grandi progressi nella selezione di ceppi rari che producono elevate quantità di CBDV, CBG e Δ 9 -THCV 48 , 49 , 50, quindi non sarebbe sorprendente vedere in un prossimo futuro varietà di cannabis ricche di altri fitocannabinoidi minori. Questa selezione genetica consentirebbe la produzione di estratti ricchi di uno specifico fitocannabinoide con un profilo farmacologico caratteristico. Per questo motivo, è importante effettuare una profilazione chimica completa di una varietà di cannabis medicinale e un’indagine approfondita dell’attività farmacologica di fitocannabinoidi minori e meno noti.

Poiché l’attività farmacologica di Δ 9- THC è particolarmente attribuita alla sua affinità per il recettore CB 1 , la letteratura suggerisce che quest’ultimo può essere aumentato allungando la catena laterale alchilica, che rappresenta la principale forza motrice farmacoforica dei cannabinoidi 14 . Pertanto, prendendo il THC come composto di piombo, una serie di cannabinoidi è stata sintetizzata chimicamente e la loro potenza biologica è risultata diverse volte superiore a Δ 9- THC stesso 15. Per quanto ne sappiamo, i cannabinoidi presenti in natura con una catena laterale alchilica più lunga di cinque termini non sono mai stati rilevati né identificati in modo putativo nella pianta di cannabis. Tuttavia, la piattaforma tecnologica all’avanguardia della spettrometria di massa Orbitrap e l’uso di tecniche analitiche avanzate come la metabolomica possono consentire la scoperta e l’identificazione di nuovi composti con un alto grado di sicurezza anche se presenti in tracce in matrici complesse 42 , 51 . Nel presente lavoro, riportiamo per la prima volta l’isolamento e la piena caratterizzazione di due nuovi omologhi eptyl di CBD e Δ 9 -THC, che abbiamo chiamato cannabidiphorol (CBDP) e Δ 9 -tetrahydrocannabiphorol (Δ 9-THCP), rispettivamente. Questi nomi comuni derivavano dalla tradizionale denominazione dei fitocannabinoidi basata sul residuo resorcinilico, in questo caso corrispondente allo sferoforolo.

I risultati biologici ottenuti nel test di legame in vitro hanno indicato un’affinità per il recettore CB 1 superiore di oltre trenta volte rispetto a quella riportata per Δ 9 -THC in letteratura 14 . Inoltre, questi dati incoraggianti sono stati supportati dalla valutazione in vivo dell’attività cannabimimetica mediante il test tetrado , in cui Δ 9- THCP ha ridotto l’attività locomotoria e la temperatura rettale, indotto la calepsia e prodotto analgesia mimando le proprietà degli agonisti del recettore CB 1 completi (Fig.  4 ). In particolare, Δ 9 -THCP si è dimostrato attivo quanto Δ 9-THC ma a dosi più basse. In effetti, la dose minima di THC utilizzata in questo tipo di test è di 10 mg / kg, mentre Δ 9- THCP risultava attivo a 5 mg / kg in tre dei quattro test di tetrad. Questi risultati, accompagnati dai dati di docking, sono in linea con gli studi approfonditi sulla relazione struttura-attività (SAR) condotti nel corso degli anni sui cannabinoidi sintetici, rivelando l’importanza della lunghezza della catena alchilica in posizione 3 sulla porzione resorcinilica nella modulazione l’affinità del ligando al recettore CB 1 .

Sebbene la quantità di omologhi epilici di CBD e Δ 9 -THC nella varietà FM2 possa apparire insignificante, sia gli studi preliminari in vitro che in vivo qui riportati su Δ 9 -THCP hanno mostrato un’attività cannabimimetica diverse volte superiore al suo omologo pentile Δ 9 -THC. Inoltre, è ragionevole supporre che altre varietà di cannabis possano contenere percentuali ancora più elevate di Δ 9- THCP. È anche importante sottolineare che esiste una sorprendente variabilità della risposta del soggetto a una terapia a base di cannabis anche con una dose uguale di Δ 9- THC 52 , 53 , 54. È quindi possibile che gli effetti psicotropi siano dovuti ad altri fitocannabinoidi estremamente attivi come Δ 9 -THCP. Tuttavia, finora nessuno ha mai cercato questo potente fitocannabinoide in varietà di cannabis medicinali. A nostro avviso, questo composto dovrebbe essere incluso nell’elenco dei principali fitocannabinoidi da determinare per una corretta valutazione dell’effetto farmacologico degli estratti di cannabis somministrati ai pazienti. In effetti, crediamo che la scoperta di un fitocannabinoide simile al THC estremamente potente possa far luce su diversi effetti farmacologici non attribuibili esclusivamente a Δ 9 -THC.

Gli studi in corso sono dedicati allo studio dell’attività farmacologica della CBDP e all’espansione di quella di Δ 9 -THCP. È noto che il CBD si lega con scarsa affinità con entrambi i recettori CB 1 e CB 55 . Pertanto, la valutazione dell’attività cannabimimetica della CBDP non sembra essere una priorità assoluta, sebbene la scienza possa riservare grandi sorprese. Il nostro attuale lavoro è piuttosto focalizzato sul test della sua attività antinfiammatoria, antiossidante e antiepilettica, tipica del CBD 46 .

metodi

Materiale vegetale

La varietà di cannabis FM2 è ottenuta dal ceppo CIN-RO prodotto dal Council for Agricultural Research and Economics (CREA) di Rovigo (Italia) e fornito all’Istituto Chimico Chimico Militare (MCPI, Firenze, Italia) per la riproduzione. L’infiorescenza FM2 (lotto n. 6A32 / 1) è stata fornita dal MCPI con l’autorizzazione del Ministero della Salute italiano (prot. N. SP / 062). Il materiale vegetale grezzo (10 g) è stato macinato finemente e diviso in due lotti: un lotto (500 mg) è stato estratto con 50 mL di etanolo al 96% secondo la procedura indicata dalla monografia di Cannabis Flos della Farmacopea tedesca 56 ed è stato analizzato da UHPLC-HESI-Orbitrap dopo adeguata diluizione con acetonitrile (× 100). I restanti 9,5 g sono stati estratti secondo il protocollo di Pellatiet al . con alcune modifiche 26 . In breve, il materiale vegetale liofilizzato è stato estratto con 400 mL di n- esano per 15 minuti sotto sonicazione in un bagno di ghiaccio. I campioni sono stati centrifugati per 10 minuti a 2000 ×  ge i supernatanti sono stati raccolti. La procedura è stata ripetuta altre due volte sul pellet. I supernatanti combinati sono stati quindi essiccati a pressione ridotta e risospesi in 10 ml di acetonitrile, filtrati e utilizzati per l’isolamento di CBDPA e THCPA mediante cromatografia liquida semi-preparativa.

Isolamento di CBDP naturale e Δ 9 -THCP

Aliquote (1 mL) della soluzione ottenuta come descritto nella sezione “Materiale vegetale” sono state iniettate in un sistema LC semi-preparativo (Octave 10 Semba Bioscience, Madison, USA). Le condizioni cromatografiche utilizzate sono riportate nell’articolo di Citti et al . 11 . La colonna utilizzata era una Luna C 18 con una fase stazionaria di silice completamente porosa (Luna 5 µm C18 (2) 100 Å, 250 × 10 mm) (Fenomenex, Bologna, Italia) e una miscela di acetronitrile: acido formico acquoso allo 0,1% 70 : 30 (v / v) è stato usato come fase mobile ad una portata di 5 ml / min. CBDPA e THCPA (tempo di ritenzione rispettivamente 19,0 min e 75,5 min) sono stati isolati come riportato nel nostro lavoro precedente 11. Le frazioni contenenti CBDPA e THCPA sono state analizzate da UHPLC-HESI-Orbitrap. Le frazioni contenenti prevalentemente l’uno o l’altro cannabinoide sono state combinate separatamente ed essiccate sul rotavapor a 70 ° C. Ogni residuo è stato sottoposto a decarbossilazione a 120 ° C per due ore in forno. È stata ottenuta una quantità di circa 0,6 mg di CBDP e circa 0,3 mg di Δ 9- THCP.

Analisi metabolomica UHPLC-HESI-Orbitrap

Gli estratti FM2 sono stati analizzati su un sistema Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 dotato di degasatore sottovuoto, pompa binaria, autocampionatore termostatato, vano colonna termostatato e interfacciato con una sorgente di ionizzazione elettrospray riscaldata e uno spettrometro di massa Q-Exactive Orbitrap (UHPLC-HESI -Orbitrap). I parametri della sorgente HESI sono stati impostati secondo Citti et al . 11 : temperatura capillare, 320 ° C; temperatura del vaporizzatore, 280 ° C; tensione elettrospray, 4,2 kV (modalità positiva) e 3,8 kV (modalità negativa); guaina gas, 55 unità arbitrarie; gas ausiliario, 30 unità arbitrarie; Livello RF dell’obiettivo S, 45. Le analisi sono state acquisite utilizzando il software Xcalibur 3.0 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) in acquisizione dipendente dai dati a scansione completa (FS-dd-MS 2) in modalità positiva (ESI +) e negativa (ESI−) a una potenza di risoluzione di 70.000 FWHM a m / z 200. Un intervallo di scansione di m / z 250–400, un AGC di 3e6, un tempo di iniezione di 100 ms e un finestra di isolamento per la filtrazione degli ioni precursore di m / z 0.7 sono stati scelti come parametri ottimali per l’analizzatore di massa. Un’energia di collisione normalizzata (NCE) di 20 è stata utilizzata per frammentare gli ioni precursore. I cromatogrammi ionici estratti (EIC) di [M + H] + e [MH] – gli ioni molecolari sono stati derivati ​​dal cromatogramma ionico totale (TIC) degli estratti di FM2 e abbinati a standard analitici puri per l’accuratezza della massa esatta (5 ppm ), tempo di ritenzione e spettro MS / MS.

La separazione cromatografica è stata effettuata su un Poroshell 120 SB-C18 (3,0 × 100 mm, 2,7 µm, Agilent, Milano, Italia) seguendo le condizioni impiegate per il nostro precedente lavoro 11 .

Un’analisi semiquantitativa di Δ 9 -THC e CBD e dei loro analoghi di eptyl CBDP e Δ 9 -THCP è stata effettuata utilizzando una curva di calibrazione con uno standard esterno. Una soluzione madre di CBD e Δ 9 -THC, CBDP e Δ 9 -THCP (1 mg / mL) è stata correttamente diluita per ottenere cinque punti di calibrazione diversi da zero alle concentrazioni finali di 50, 100, 250, 500 e 1000 ng / mL per CBD e Δ 9 -THC e di 1, 5, 10, 25 e 50 ng / mL per CBDP e Δ 9 -THCP. Una soluzione standard di Δ 9 -THC- 3 è stata aggiunta ad ogni standard di calibrazione ad una concentrazione finale di 50 ng / mL. La linearità è stata valutata dal coefficiente di determinazione ( 2), che era maggiore di 0,993 per ciascun analita.

Procedura sintetica

Tutti i reagenti e i solventi sono stati impiegati come acquistati senza ulteriore purificazione, se non diversamente specificato. Nel presente documento sono state utilizzate le seguenti abbreviazioni per solventi organici comuni: dietil etere (Et 2 O); diclorometano (DCM); cicloesano (CE). Il monitoraggio della reazione è stato eseguito mediante cromatografia su strato sottile su gel di silice (60F-254, E. Merck) e controllato con luce UV o soluzione acquosa alcalina KMnO 57 , 58 , 59 . I prodotti di reazione sono stati purificati, se necessario, mediante cromatografia flash su gel di silice (40-63 μm) con il sistema solvente indicato. Gli spettri NMR sono stati registrati su uno spettrometro Bruker 400 o Bruker 600 funzionante rispettivamente a 400.134 MHz e 600.130 MHz per 1H e a 100,62 MHz o 150,902 MHz per 13 C. Gli spostamenti chimici (δ) sono in parti per milione (ppm) e sono stati riferiti ai picchi residui di solvente (CDCl 3 δ = 7,26 ppm per protone e δ = 77,20 ppm per carbonio ); le costanti di accoppiamento sono riportate in Hertz (Hz); i modelli di divisione sono espressi con le seguenti abbreviazioni: singoletto (i), doppietto (d), tripletta (t), quartetto (q), doppio doppietto (dd), quintetto (qnt), multiplo (m), segnale largo (b) . Gli spettri monodimensionali sono stati acquisiti con una larghezza spettrale di 8278 Hz (per 1 H-NMR) e 23,9 kHz (per 13 C-NMR), un ritardo di rilassamento di 1 s e 32 e 1024 numero di transitori per 1 H-NMR e 13 C-NMR, rispettivamente 12. Gli spettri COSY sono stati registrati come una matrice 2048 × 256 con 2 transitori per incremento di t1 ed elaborati come una matrice 2048 × 1024; gli spettri HSQC sono stati raccolti come una matrice 2048 × 256 con 4 transitori per incremento di t1 ed elaborati come una matrice 2048 × 1024 e il valore di accoppiamento eteronucleare un legame è stato impostato su 145 Hz; gli spettri HMBC sono stati raccolti come una matrice 4096 × 256 con 16 transitori per incremento di t1 ed elaborati come una matrice 4096 × 1024 e il valore di accoppiamento a lungo raggio è stato impostato su 8 Hz 12 . Dicroismo circolare (CD) e spettri UV sono stati acquisiti su uno spettropolarimetro Jasco (Tokyo, Giappone) J-1100 usando una velocità di scansione di 50 nm / min. Sono state impiegate celle al quarzo con una lunghezza del percorso di 10 mm per registrare spettri nell’intervallo 500–220 nm 12. La rotazione ottica (λ) è stata misurata con un Polarimetro 241 (lunghezza della cella 100 mm, volume 1 mL) di Perkin-Elmer (Milano, Italia). Le procedure sintetiche descritte di seguito sono state adattate da lavori precedentemente pubblicati 12 , 57 .

Sintesi di (1 ′ R, 2 ′ R) -4-eptil-5 ′ -metil-2 ′ – (prop-1-en-2-il) -1 ′ , 2 ′ , 3 ′ , 4 ′ -tetraidro- [1,1 ′ -difenil] -2,6-diolo, (-) – trans-CBDP

(1  S , 4  R ) -1-metil-4- (prop-1-en-2-il) cicloex-2-enolo (146 mg, 0,96 mmoli, 0,9 eq.), Solubilizzato in 15 ml di DCM anidro, è stato aggiunto per un periodo di 20 minuti a una soluzione agitata di 5-eptilbenzene-1,3-diolo (222 mg, 1,07 mmoli, 1 eq.) e acido p- toluensolfonico (20 mg, 0,11 mmoli, 0,1 eq.) in DCM anidro (15 mL) a temperatura ambiente e sotto una pressione positiva di argon. Dopo agitazione nelle stesse condizioni per 1 ora, la reazione è stata spenta con 10 mL di una soluzione acquosa satura di NaHCO 3 . La miscela fu ripartita tra Et 2 O e acqua. Lo strato organico è stato separato e lavato con salamoia, essiccato con Na 2 SO 4 anidroed evaporato. Il residuo è stato cromatografato (rapporto grezzo: silice 1/120, eluente: CE: DCM 8/2). Tutte le frazioni cromatografiche sono state analizzate mediante HPLC-UV e UHPLC-HESI-Orbitrap e solo le frazioni contenenti esclusivamente CBDP sono state concentrate per dare 76 mg di un olio incolore (resa del 23%, purezza> 99%).

1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.10–6.30 (m, 2 H), 5.97 (bs, 1 H), 5.57 (s, 1 H), 4.66 (s, 1 H), 4.66 (bs, 1 H), 4,56 (s, 1H), 3,89-3,81 (m, 1H), 2,52–2,35 (m, 3 H), 2,24 (td, J  = 6,1, 12,7 Hz, 1H), 2,09 (ddt, J  = 2.4, 5.1, 17.9 Hz, 1 H), 1.89–1.74 (m, 5 H), 1.65 (s, 3 H), 1.55 (qnt, J  = 7.6 Hz, 2 H), 1.28 (td, J  = 4.7, 8.2, 9.0 Hz, 8 H), 0.87 (t, J  = 6.7 Hz, 3 H). 13 C NMR (101 MHz, CDCl 3 ) δ 156.27, 154.09, 149.56, 143.23, 140.22, 124.30, 113.93, 111.01, 109.91, 108.26, 46.33, 37.46, 35.70, 31.99, 31.14, 30.59, 29.43, 29.35, 28.60, 23.86 , 22,84, 20,71, 14,29. HRMS m / z [M + H] + calcd. per C23 H 35 O + : 343.2632. Trovato: 343.2629; [MH]  calcd. per C 23 H 33 O  : 341.2475. Trovato: 341.2482. [α] 20  = −146 ° ( c  1.0, ACN).

Sintesi di (6aR, 10aR) -3-eptil-6,6,9-trimetil-6a, 7,10,10a-tetraidro-6H-benzo [c] chromen-1-ol, (-) – trans-Δ -THCP

L’impostazione della reazione per la sintesi di (-) – trans-Δ -THCP è stata eseguita come descritto per (-) – trans-CBDP e la miscela risultante è stata agitata a temperatura ambiente per 48 ore. La miscela è stata diluita con Et 2 O e lavata con una soluzione satura di NaHCO 3 (10 mL). Lo strato organico è stato raccolto, lavato con salamoia, essiccato (Na 2 SO 4 anidro ) e concentrato. Dopo purificazione su gel di silice (rapporto grezzo: silice 1/150, eluente: CE: Et 2 O 95/5) sono stati ottenuti 315 mg di un olio incolore (resa del 46%).

1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.28 (d, J  = 1.6 Hz, 1 H), 6.10 (d, J  = 1.6 Hz, 1 H), 5.46–5.39 (m, 1 H), 4.78 (s , 1H), 3,20 (dd, J  = 4.5, 16.0 Hz, 1 H), 2.70 (td, J  = 4.7, 10.8 Hz, 1 H), 2.44 (td, J  = 2.3, 7.4 Hz, 2 H), 2,21–2,10 (m, 1H), 1,92–1,76 (m, 3 H), 1,70 (s, 3 H), 1,63–1,52 (m, 2 H), 1,38 (s, 3 H), 1,30 (tt, J  = 4,3, 9,4, 11,8 Hz, 8 H), 1,11 (s, 3 H), 0,88 (t, J  = 7,0 Hz, 3 H).

Sintesi di (6aR, 10aR) -3-eptil- 9 -cloro-6,6,9-trimetil-6a, 7,8,9,10,10a-hexahydro-6H-benzo [c] chromen-1-ol ( HCl-THCP)

1 N ZnCl 2 in Et 2 O (440 µL, 0,44 mmol, 0,5 eq.) È stato aggiunto a una soluzione agitata di Δ 8 -THCP (300 mg, 0,87 mmol, 1 eq.) In 20 mL di DCM anidro, a camera temperatura e atmosfera di azoto. Dopo 30 minuti, la reazione è stata raffreddata a 0 ° C e sono stati aggiunti 2 mL di HCl 4 N in diossano. La miscela risultante è stata agitata a temperatura ambiente, durante la notte e quindi diluita con Et 2 O. Lo strato organico è stato raccolto e lavato, in sequenza, con una soluzione acquosa satura di NaHCO 3 e salamoia. Dopo disidratazione con Na 2 SO 4 anidro, la fase organica è stata concentrata per dare 305 mg (93% di resa) di un olio giallastro, abbastanza puro per essere usato nella fase successiva senza ulteriore purificazione.

1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.24 (d, J  = 1.7 Hz, 1 H), 6.07 (d, J  = 1.6 Hz, 1 H), 4.94 (s, 1 H), 3.45 (dd, J  = 2.9, 14.4 Hz, 1 H), 3.05 (td, J  = 2.9, 11.3 Hz, 1 H), 2.42 (td, J  = 1.5, 7.4 Hz, 2 H), 2.20–2.12 (m, 1 H), 1,80–1,71 (m, 1H), 1,66 (s, 4 H), 1,60–1,51 (m, 2 H), 1,49–1,42 (m, 1 H), 1,38 (s, 3 H), 1,34-1,18 ( m, 10 H), 1,13 (s, 3 H), 0,87 (t, J  = 6,6 Hz, 3 H). ESI-MS m / z [M + H] + calcd. per C 23 H 36 35 [Cl] O + : 379.2. Trovato: 379,4. Cale. per C 23 H 36 37 [Cl] O 2+ : 381,2. Trovato: 381.3.

Sintesi di (6aR, 10aR) -3-eptil-6,6,9-trimetil-6a, 7,8,10a-tetraidro-6H-benzo [c] chromen-1-olo, (-) – trans-Δ 9 -THCP .

HCl-THCP (305 mg, 0,82 mmol, 1 eq.) È stato solubilizzato in 10 ml di toluene anidro e raffreddato a -15 ° C. 1.75 N potassio t- amilato in toluene (1,17 mL, 2,05 mmol, 2,5 eq.) È stato aggiunto goccia a goccia con una siringa per la prima soluzione sotto una pressione positiva di argon. La miscela è stata agitata nelle stesse condizioni per 15 minuti e quindi a 60 ° C per 1 ora. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, la reazione è stata spenta con una soluzione all’1% di acido ascorbico e diluita con Et 2 O. Lo strato organico è stato lavato con salamoia, essiccato su Na 2 SO 4 anidro e concentrato. Il residuo è stato cromatografato (rapporto greggio / silice 1: 300, esano: i- propil etere 9/1) per dare 232 mg di un olio verdastro (resa dell’83%). 50 mg di (-) –trans -Δ 9 -THCP sono stati ulteriormente purificati mediante HPLC semipreparativo per preparare uno standard analitico puro (purezza> 99,9%).

1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ 6.30 (t, J  = 2.0 Hz, 1 H), 6.27 (d, J  = 1.6 Hz, 1 H), 6.14 (d, J  = 1.5 Hz, 1 H), 4,75 (s, 1H), 3,20 (dt, J  = 2,5, 10,8 Hz, 1 H), 2,43 (dd, J  = 6,4, 8,9 Hz, 2 H), 2,22–2,11 (m, 2 H), 1,97– 1,87 (m, 1H), 1,69–1,65 (m, 4H), 1,58–1,50 (m, 2 H), 1,43–1,37 (m, 4 H), 1,34-1,21 (m, 8 H), 1,09 ( s, 3 H), 0,87 (t, J  = 6,6 Hz, 3 H). 13 C NMR (151 MHz, CDCl 3 ) δ 154.97, 154.34, 143.02, 134.59, 123.92, 110.30, 109.22, 107.72, 77.38, 46.01, 35.72, 33.78, 31.99, 31.37, 31.16, 29.50, 29.38, 27.77, 25.22, 23.55 , 22.87, 19.47, 14.29. HRMS m / z [M + H] +Cale. per C 23 H 35 O + : 343.2632. Trovato: 343.2633; [MH]  calcd. per C 23 H 33 O  : 341.2475. Trovato: 341.2481. [α] 20  = −166 ° ( c 1.0, ACN).

Legame ai recettori CB 1 e CB 2

L’affinità di legame di (-) – trans -Δ 9 -THCP con i recettori CB 1 e CB 2 umani è stata valutata da Eurofins Discovery usando un saggio di legame con radioligando. Dieci concentrazioni del fitocannabinoide da 1 nM a 30 µM sono state testate in duplicato. [ 3 H] CP55940 (a 2 nM, d  = 2,4 nM) e [ 3 H] WIN 55212-2 (a 0,8 nM, d  = 1,5 nM) sono stati usati come radioligando specifico per h CB 1 e h CB 2 , rispettivamente 60 , 61 . Equazione  1è stato impiegato per calcolare l’inibizione percentuale ( % in ) del legame specifico al controllo ottenuto in presenza dei composti testati.% i n = 100 – ( m e a s u r e ds p e c i fio cb i n di n gc o n t r o ls p e c i fio cb i n di n g∗ 100 )%ion=100-(meun’SuredSpeciofiocBiondiongcontrolSpeciofiocBiondiong*100)(1)

Un’analisi di regressione non lineare delle curve di competizione generate con valori replicati medi (Eq.  2 ) è stata utilizzata per calcolare i valori IC 50 (concentrazione che causa un’inibizione semi-massima del legame specifico del controllo) 62 .Y= D + [ A – D1 + ( CC50) n H]Y=D+[UN-D1+(CC50)nH](2)

Dove Y è il legame specifico, A è l’asintoto sinistro della curva, D è l’asintoto destro della curva, C è la concentrazione composta, C 50 è il valore IC 50 e nH è il fattore di pendenza. Questa analisi è stata effettuata utilizzando un software sviluppato presso Cerep (software Hill) e validato confrontando i dati con quelli generati dal software commerciale SigmaPlot 4.0 per Windows (1997 da SPSS Inc.). Le costanti di inibizione ( i ) sono state determinate usando l’equazione di Cheng Prusoff (Eq.  3 ):Ki = IC50( 1 + LKD)Kio=ioC50(1+LKD)(3)

dove L è la concentrazione del radioligando e D è l’affinità del radioligando per il recettore.

I dati ottenuti per CP 55940 (CB 1 IC 50  = 1,7 nM, CB i  = 0,93 nM) e WIN 55212-2 (CB 2 IC 50  = 2,7 nM, CB i  = 1,7 nM) erano conformi al valori riportati in letteratura 60 , 61 .

Simulazione di docking

La previsione della modalità di legame di Δ 9- THCP in complesso con il recettore CB 1 umano è stata eseguita usando il Maestro 10.3 della Suite 63 di Schrödinger . La struttura cristallografica della conformazione attiva di CB 1 nel complesso con AM11542 (ID PDB: 5XRA) è stata scaricata dalla banca di dati proteici ed è stata utilizzata come riferimento per il calcolo di docking. La proteina è stata preparata utilizzando il modulo 64 di Preparazione guidata proteine . La struttura chimica di (-) – trans -Δ 9 -THCP è stata disegnata con ChemDraw 12.0 e convertita da 2D a 3D con l’utilità LigPrep 65. Inizialmente sono state generate cinque conformazioni per ligando e sono stati valutati lo stato di ionizzazione e i tautomeri appropriati per ciascuna conformazione a pH fisiologico 66 , 67 . Successivamente, le conformazioni dei ligandi sono state ridotte al minimo con il campo di forza OPLS_2005. L’attracco rigido è stato eseguito in modalità di precisione extra con la versione Glide 6.8 68 .

Test di Tetrad

Topi maschi C57BL6 / J (7 settimane; n  = 5) sono stati trattati con Δ 9- THCP (10, 5 e 2,5 mg / kg) o veicolo (1: 1: 18; etanolo: Kolliphor EL: soluzione salina allo 0,9%) da amministrazione ip. I topi sono stati valutati per gli effetti di ipomotilità (test in campo aperto), ipotermia (temperatura corporea), antinocicettivi (test su piastre riscaldanti) e catalepici (test su barra), utilizzando le procedure dei test tetradi come riportato da Metna-Laurent et al . 69 . Gli stessi animali sono stati utilizzati in tutti e quattro i test comportamentali. L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test Kruskall-Wallis e i test post hoc di Dunn.

Temperatura corporea

Il mouse è stato immobilizzato e la sonda è stata inserita delicatamente per 1 cm nel retto fino alla stabilizzazione della temperatura. Tra ogni topo la sonda è stata pulita con etanolo al 70% ed essiccata con un tovagliolo di carta.

Campo aperto

Il test in campo aperto è stato utilizzato per la valutazione dell’attività motoria. I saggi comportamentali sono stati eseguiti 30 minuti dopo l’iniezione del farmaco (o del veicolo). L’apparato è stato pulito prima di ogni sessione comportamentale con una soluzione di etanolo al 70%. I topi Naϊve sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo di trattamento. I comportamenti sono stati registrati, archiviati e analizzati utilizzando un sistema di tracciamento comportamentale automatizzato (Smart v3.0, Panlab Harvard Apparatus). I topi sono stati collocati in un’arena OFT (l × w × h: 44 cm × 44 cm × 30 cm) e l’attività ambulatoriale (distanza totale percorsa in centimetri) è stata registrata per 15 minuti e analizzata.

Test della barra

Il test a barra è stato utilizzato per la valutazione della catalepsia. La barra era lunga 40 cm e con un’asta di vetro di 0,4 cm di diametro, sollevata orizzontalmente di 5 cm sopra la superficie. Entrambi gli arti anteriori del topo erano posizionati sulla barra e le zampe posteriori sul pavimento della gabbia, assicurando che il topo non fosse sdraiato sul pavimento. Il cronometro è stato arrestato quando il mouse è sceso dalla barra (ovvero quando le due zampe anteriori hanno toccato il pavimento) o quando sono trascorsi 10 minuti (ovvero il tempo di interruzione). La catalepsia è stata misurata come la durata del tempo in cui ciascun topo ha tenuto la barra elevata per entrambi gli arti anteriori (latenza per muoversi in secondi).

Piatto caldo

Il test della piastra riscaldante è stato eseguito per valutare i cambiamenti nella nocicezione. Il giorno dell’esperimento ogni topo è stato posizionato su una piastra calda (Ugo Basile) che è stata mantenuta a una temperatura costante di 52 ° C. La leccata delle zampe posteriori o il salto sono stati considerati una risposta nocicettiva (NR) e la latenza è stata misurata in secondi 85 minuti dopo la somministrazione del farmaco o del veicolo, prendendo un tempo di interruzione di 30 o 60 s al fine di prevenire danni ai tessuti.

Animali

Topi maschi C57BL / 6 (Charles River, Italia) di 18-20 g di peso sono stati usati per gli esperimenti di tetrado. Un ciclo luce / buio di 12 ore con luce accesa alle 6:00, una temperatura costante di 20–22 ° C e un’umidità del 55–60% sono stati mantenuti per almeno 1 settimana prima di iniziare gli esperimenti. I topi erano alloggiati tre per gabbia con acqua di rubinetto e acqua disponibile ad libitum. Le procedure sperimentali impiegate per il lavoro qui presentato sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell’Università della Campania “L. Vanvitelli ”, Napoli. La cura e il benessere degli animali sono stati affidati a personale adeguatamente addestrato in conformità con le normative italiane (DL 116/92) e della Commissione Europea (GU L358 / 1, 18/12/86) sulla protezione degli animali utilizzati a fini di ricerca. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali ed evitare sofferenze inutili durante gli esperimenti.

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Scarica riferimenti

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal progetto di ricerca UNIHEMP “Uso della biomassa di canapa iNdustrIal per l’energia e la nuova produzione biochimica” (ARS01_00668) finanziato dal Fondo Europeo di Sviluppo Regionale (FESR) (all’interno del PON R&I 2017–2020 – Asse 2 – Azione II – OS 1.B). Concedere il decreto UNIHEMP prot. n. 2016 del 27/07/2018; TAZZA B76C18000520005. Siamo anche grati all’Istituto Chimico Chimico Militare di Firenze per aver fornito l’infiorescenza di cannabis FM2.

Informazioni sull’autore

Note dell’autore

  1. Questi autori hanno contribuito allo stesso modo: Cinzia Citti e Pasquale Linciano.

affiliazioni

  1. Società spin-off di Mediteknology del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Via Arnesano, 73100, Lecce, Italia
    • Cinzia Citti
  2. Istituto di Nanotecnologia del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR NANOTEC), Via Monteroni, 73100, Lecce, Italia
    • Cinzia Citti
    • , Aldo Laganà
    • , Giuseppe Gigli
    •  E Giuseppe Cannazza
  3. Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia, Via Campi 103, 41125, Modena, Italia
    • Cinzia Citti
    • , Pasquale Linciano
    • , Fabiana Russo
    • , Flavio Forni
    • , Maria Angela Vandelli
    •  E Giuseppe Cannazza
  4. Dipartimento di Medicina Sperimentale, Divisione di Farmacologia, Università della Campania “L. Vanvitelli ”, Via Santa Maria di Costantinopoli 16, 80138, Napoli, Italia
    • Livio Luongo
    • , Monica Iannotta
    •  E Sabatino Maione
  5. Dipartimento di Chimica, Sapienza Università di Roma, Piazzale Aldo Moro 5, 00185, Roma, Italia
    • Aldo Laganà
    •  E Anna Laura Capriotti

contributi

GC ha sviluppato e supervisionato il progetto, CC e PL hanno ideato il piano di esperimenti e redatto il manoscritto, CC e FR hanno effettuato le analisi UHPLC-HRMS, PL ha eseguito le sintesi e la caratterizzazione stereoselettive, PL e GG hanno eseguito le simulazioni di docking, LL, MI e SM ha eseguito i test di tetrad in vivo , AL e ALC hanno sviluppato il metodo di semi-quantificazione, FF e MAV hanno analizzato i dati del dosaggio di legame. Tutti gli autori hanno recensito il manoscritto.

autore corrispondente

Corrispondenza con Giuseppe Cannazza .

Dichiarazioni etiche

Interessi conflittuali

Gli autori non dichiarano interessi in conflitto.

Informazioni aggiuntive

Nota dell’editore Springer Nature rimane neutrale rispetto alle rivendicazioni giurisdizionali nelle mappe pubblicate e nelle affiliazioni istituzionali.

Informazione supplementare

Informazione supplementare.

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Ristampe e autorizzazioni

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Citti, C., Linciano, P., Russo, F. et al. Un nuovo fitocannabinoide isolato dalla Cannabis sativa L. con un’attività cannabimimetica in vivo superiore a Δ 9- tetraidrocannabinolo: Δ 9 -Tetraidrocannabiphorol. Sci Rep 9, 20335 (2019) doi: 10.1038 / s41598-019-56785-1

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